克隆血管生成素樣蛋白技術(shù)闡述

　　克隆血管生成素樣蛋白2(angiopoietin like protein2,ANGPTL2)cDNA;構(gòu)建ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域原核表達(dá)載體;表達(dá)得到ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域融合蛋白;制備針對(duì)ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域的多克隆抗體,為全面分析研究ANGPTL2的功能及其與糖尿病腎病微血管病變的關(guān)系創(chuàng)造條件。

　　方法:利用RT-PCR方法從腎臟總RNA中擴(kuò)增ANGPTL2全長cDNA;以其為模板擴(kuò)增編碼ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域的cDNA片段,并進(jìn)而將其克隆至原核表達(dá)載體pET-15b上,構(gòu)建成ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域的原核表達(dá)載體pET-ANGPTL2;將pET-ANGPTL2導(dǎo)入BL21(DE3)菌內(nèi),通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白;利用重組蛋白5'端帶有Histag的特點(diǎn),采用含Ni的樹脂進(jìn)行親和吸附純化,獲取高純度的重組蛋白;將重組蛋白免疫新西蘭大白兔,制備兔抗ANGPTL2多克隆抗體;利用ELISA法測(cè)定和免疫組化分析對(duì)此多抗的效價(jià)和特異性進(jìn)行分析。

　　結(jié)果:取得了帶有完整閱讀框的ANGPTL2全長cDNA;構(gòu)建成與預(yù)先設(shè)計(jì)完全一致的原核表達(dá)載體pET-ANGPTL2;成功地在大腸桿菌中進(jìn)行了ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域融合蛋白的表達(dá),純化獲取純度很高的重組蛋白;經(jīng)免疫兔獲取高效價(jià)的針對(duì)ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域的多克隆抗體;ELISA檢測(cè)和免疫組化分析表明,此抗體不僅具有很高的效價(jià),而且具有很好的特異性。結(jié)論:我們成功地克隆了ANGPTL2cDNA,構(gòu)建了其原核表達(dá)載體,進(jìn)行了原核表達(dá),成功取得高純度的重組蛋白,并得到了高效價(jià)、高特異性針對(duì)ANGPTL2纖維蛋白原樣功能域的多克隆抗體,為全面分析研究ANGPTL2功能及其與糖尿病腎病微血管病變的關(guān)系創(chuàng)造條件。