小量細(xì)菌克隆的雜交法篩選實驗步驟方法

小量細(xì)菌克隆的雜交法篩選實驗步驟方法:

1. 將硝酸纖維膜或尼龍膜鋪于含有選擇性抗菌素的瓊脂板（實驗平板）上。

由于手指上的油會影響濾膜浸濕并妨礙 DNA 轉(zhuǎn)移，操作濾膜時應(yīng)帶上手套。

2. 在一張繪圖紙上畫出數(shù)字標(biāo)記的方格（方格大小 1 cm2 )，在每一塊瓊脂主板的底部標(biāo)記數(shù)字，并把瓊脂板放在方格紙上，在瓊脂板邊緣的 6 點(diǎn)鐘位置上作好標(biāo)記。

這樣標(biāo)記將使主板于方格的方向一致。

3. 用無菌牙簽或接種環(huán)將菌落逐一地轉(zhuǎn)移至實驗板的濾膜上和含有選擇性抗菌素的主板上（沒有濾膜）。按照板下方的方格將菌落劃成 2~3 mm 的短線或點(diǎn)，每一菌落在兩塊板中的位置相同。

一塊 90 mm 板可劃 100 個克隆。

4. zui后在濾膜和主瓊脂板上各劃一個含非重組質(zhì)粒（如 pUC) 的克隆。

陰性對照對于用放射性探針區(qū)別空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒是必要。從重組質(zhì)粒的限制酶切產(chǎn)物和瓊脂糖電泳中提取的 DNA 片段常被質(zhì)粒 DNA 序列污染，當(dāng)污染的 DNA 片段用作雜交探針進(jìn)行轉(zhuǎn)化克隆的 Grunstein-Hogness 篩選時，就會造成麻煩。

5. 倒置瓊脂板置于 37℃ 培養(yǎng)直至菌線的寬度校至 0.5~1.0 mm ( 通常需 6~16 h）。

這一階段，如細(xì)菌生長仍然很快，濾膜應(yīng)轉(zhuǎn)至含有*的瓊脂板，再于 37℃ 進(jìn)一步培養(yǎng) 12 h（Hanahan and Meselson 1980，1983)。這個擴(kuò)增的過程只有在重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)預(yù)計很低的情況下（如插入的是較大的外源 DNA 片段 )，或當(dāng)簡并度較高的寡核苷酸用作探針時，是必要的。克隆的 DNA 片段通常很容易通過雜交被檢出，不需要預(yù)*行重組質(zhì)粒的擴(kuò)增。擴(kuò)增只對那些以松散方式復(fù)制的質(zhì)粒是有效的。

6. 在三個或更多不對稱的位置上標(biāo)記濾膜，用連在裝有防水墨汁注射器上的 18 號針頭將濾膜刺穿直至實驗板的瓊脂中。在主板相近的位置上也作同樣標(biāo)記。

實踐中，用空的 18 號針頭在濾膜和下層瓊脂間穿孔而避免使用墨水（墨水會弄得很臟），是可能的，雜交 后，通過來自光盒的背光可以對濾旗上的孔與瓊脂上的痕跡進(jìn)行校對。

很多研究者更喜歡用剪刀在濾膜四周不同位置上剪出缺口的方法來確定方向。將剪出缺口并作好標(biāo)記的濾膜置于瓊脂表面，而后在培養(yǎng)板背面標(biāo)記出濾膜鋸齒狀邊緣的位置。這樣通過鋸齒的形狀和位置就可確定在培養(yǎng)板上的方向。

7. 用 Parafilm 膜將主板封好，顛倒后于 4℃ 保存，直至得出雜交實驗的結(jié)果。

8. 裂解附著于濾膜上細(xì)菌，將釋放出的 DNA 結(jié)合到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。進(jìn)行雜交。小量細(xì)菌克隆的雜交法篩選實驗步驟，