小鼠腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒檢測原理

小鼠腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒檢測原理

     將目標抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的目標連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入辣根過氧化物酶標記的抗體，將未結(jié)合的抗體洗凈后再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。在實驗操作過程中，需嚴格控制反應(yīng)條件以確保檢測結(jié)果的準確性。首先，標準品和樣本的加樣體積需精確至微升級別，避免因加樣誤差導(dǎo)致標準曲線偏移。洗滌步驟尤為關(guān)鍵，需采用洗板機或手動充分洗滌，每次洗滌后需在吸水紙上拍干孔內(nèi)液體，避免交叉污染。

    顯色反應(yīng)對時間和溫度敏感，建議在25℃避光環(huán)境下孵育15-30分鐘，待標準品孔出現(xiàn)明顯梯度藍色后，及時加入終止液終止反應(yīng)。終止后30分鐘內(nèi)應(yīng)完成讀數(shù)，避免顏色衰減影響OD值。

    數(shù)據(jù)分析時，建議采用四參數(shù)邏輯曲線擬合（4PL）法繪制標準曲線，其能更好地反映低濃度與高濃度區(qū)間的非線性關(guān)系。若樣本OD值超出標準曲線范圍，需用稀釋液適當(dāng)稀釋后重新檢測。此外，復(fù)孔檢測的CV值應(yīng)控制在15%以內(nèi)，以確保數(shù)據(jù)可靠性。

    該試劑盒適用于血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液等樣本類型，但需注意避免反復(fù)凍融或溶血樣本，以免干擾檢測。通過優(yōu)化實驗流程和嚴格質(zhì)控，可高效評估炎癥、感染或腫瘤微環(huán)境中的TNF-α水平，為基礎(chǔ)研究與臨床診斷提供精準數(shù)據(jù)支持。