基于細胞的ELISA技術不僅簡化實驗流程

   盡管體外生物化學激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假說檢驗和藥物篩選，但它們無法復制細胞內的環境。分析完整細胞內的蛋白磷酸化也許能更準確地代表特定信號通路網絡的狀態。一些免疫分析最近被開發出來，能夠在完整細胞的背景下測定蛋白磷酸化。細胞在同一個孔中被刺激、固定和阻斷。使用磷酸化特異抗體，利用熒光或顯色檢測系統來評估磷酸化狀態。此外，在微孔板的同一個孔中同時檢測磷酸化蛋白和總蛋白。因此，來自目的蛋白的信號可通過第二種蛋白來標準化，校正各孔之間的差異，實現磷酸化蛋白水平的準確評估，并比較多個樣品，與傳統免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過了制備細胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析。基于細胞的ELISA技術不僅簡化了實驗流程，還為信號通路研究提供了更接近生理狀態的數據。這種方法的創新之處在于，它巧妙地將細胞刺激、固定與檢測整合在同一個微孔中，**限度地保留了蛋白質的天然構象和相互作用網絡。  

實驗過程中，細胞的固定尤為關鍵，既要確保磷酸化位點的充分暴露，又要避免過度交聯導致抗體無法識別表位。研究人員發現，溫和的多聚甲醛固定結合透膜處理，能夠在保持細胞結構完整性的同時，允許抗體高效結合目標蛋白。此外，阻斷步驟的優化也顯著降低了背景信號——使用含5%BSA和0.1%Tween-20的緩沖液，能有效減少非特異性結合，提高信噪比。  

在數據分析方面，雙抗體檢測系統（磷酸化抗體與總蛋白抗體）的同步應用，使得結果標準化更為精準。通過計算磷酸化信號與總蛋白信號的比值，可以消除細胞數量差異、孔間加樣誤差等變量干擾。這種內參校正方式，尤其適用于藥物梯度實驗或時間序列研究，例如觀察激酶抑制劑在不同濃度下對信號通路的動態影響。